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双光子成像系统

更新时间:2018-08-30

简要描述:

双光子吸收/激发技术的原理:在强光激发下,分子同时吸收两个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。

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       双光子吸收/激发技术的原理:在强光激发下,分子同时吸收两个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。两个光子可以是相同波长的,也可以是不同波长的,但必须是同时吸收(两个光子到达被激发分子的时间间隔小于1飞秒)。可以这样理解,先吸收一个光子的能量跃迁到一个虚拟的中间态,然后再吸收一个光子的能量跃迁到激发态。 双光子显微镜相对于共聚焦等其他显微镜的优点: ~ 光损伤小:由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源,这一波段的光对活体细胞和组织的光损伤小,适用于长时间的研究; ~ 穿透能力强:相对于紫外光,可见光和近红外光都具有更强的穿透能力,因而受生物组织散射的影响更小,解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题;研究表明,共聚焦荧光成像的成像深度一般在50微米左右,而双光子显微镜的成像深度可达1000微米; ~ 高分辨率:由于双光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光,双光子吸收仅局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内

在体可倾斜双光子显微成像系统 双光子显微成像系统的原理 双光子显微成像系统如何实现 • 红外激光秒级脉冲要求– IV级别; • 可调钛:蓝宝光源; • 光到达焦点同步性; • 能量叠加在焦点激发荧光; • 光能量以在焦点激发个荧光事件; • 要求必须在个常的样本区域激发染料; • 分辨率; • 激发和发射都需要分辨率 , 因为我们要激发个常的点,我们必须保持移动的点,以激发整个样品,这是 次扫描,我们使电动旋转反射移动这点,个移动的位置在X(左/右)和 个移动位置在Y(向上/向下) 下的图显了个简化的相机传感器,每个圆圈是个敏感的像素 当个相机成像时,光是从样品上的个单独的像素位点到达传感器的, 传感器同时能读取这个像素位点的信息 但是PMT不同于相机成像,它是个光敏感像素,并且它能分辨出光量多少 我们需要将样品分成更多的积区域,PMT逐读取每个区域的光信息,即我们 通常所说的像素 PMT读取顺序 • 软件将PMT采集到的这些信息重新组建成类似于赛克样的图,我们可以很清 晰的还原图像。 双光子显微成像系统的用途 • 在较厚的物样品中采集到较薄的光学切荧光图像; • 在体双光荧光成像,可在活体动物组织上实现超过300微的成像深度,观察感兴趣神经细 胞的快速3D动态变化; • 对于需要超镜下空间的实验动物更有优势,如清醒动物实验平台; • 在体可倾斜——双光成像物镜可在三维平内做任意度的倾斜,以适应不同样品不同成像 区域的需求; • 双光成像系统可为在体电理记录提供图像信息,实现对特定标神经元的纪录; • 可以与电理记录、动物为测量系统相互触发,实现同步纪录; 双光子显微成像系统的成像特点 • 在体可倾斜——双光成像物镜可在三维平内做 任意度的倾斜,以适应不同样品不同成像区域的 需求 • 三维深层扫描 • 扫描深度可达900微 • 只激发焦点区域,光毒性 • 信噪,图像清晰度 1. 任意度在体双光显微成像系统是套采功率超快秒脉冲激光器作为激 发光源、在较厚的物样品中采集到较薄的光学切荧光图像的显微镜设备; 2. 主要应于在体双光荧光成像,可在活体动物组织上实现超过300微的成像深 度,观察感兴趣神经细胞的快速3D动态变化; 3. 对于需要超镜下空间的实验动物更有优势,如清醒动物实验平台。双光 成像物镜可在三维平内做任意度的在体图像,以适应不同样品不同成像区域 的需求。 双光子显微成像系统能解决的问题 购买双光子显微成像系统的必要性 1. 在体研究的必要性: 味觉,视觉,嗅觉,听觉,触觉是动物所能接受的所有外部刺激,脑就是依靠这五种 感官的输来认知、学习与记忆整个外部世界的。前来说,科研从in vitro到in vivo,多数in vivo实验是在醉动物上实现的,如何对freely moving animal进研究成了科研难点。相 对于醉状态下的动物来说, freely moving animal的动物才是命最真实的状态,在freely moving animal上的实验所得到的数据也才是最可靠的数据。 购买双光子显微成像系统的必要性 2. 前科研研究现状: 我们在研究脑功能时,通最常的法就是神经电理的法,如我们想知道脑某些特 定的区域或者特定的细胞,执什么功能,先要设置个合理的任务,研究动物的为,如 旷场试验,迷宫实验,架迷宫实验,同时我们会定量记录脑的电理的活动,从看脑的 电理活动与这个任务是如何相关的,也就是说对脑的电理活动与动物为学进相关性 分析,那我们就可以知道,动物在做某些特定为的时候,脑哪些细胞在放电,哪些脑区会有反 应.这是较典型的做法。由于前在体电理多数是采盲插的式,我们看不到细胞的 具体形态,如果与双光技术结合,我们就既可以看到细胞的放电活动,可以观察细胞在 形态学上的特征,从更好的研究神经细胞的功能及其特点。 双光子显微成像系统在我平台的应用 1. 主要应于清醒动物在体荧光(结构与钙离功能)成像,可以与本课题组开发搭建的虚拟现实为学 平台相结合,实现在实验动物的为学习过程中,对其神经环路的功能和形态的变化进期观察(chronic imaging); 2. 该系统与膜钳系统结合,实现双光成像引导下的标膜钳记录(two-photon microscopy guided targeted patch-clamp recordings),可以将功能成像的群体记录(population recordings)与单细胞阈值下的膜电位 (single-cell subthreshold membrane potential recordings)相结合,揭神经络的活性是如何决定络中单 个神经元的表征的; 3. 该系统还配备了单细胞电穿仪(single-cell electroporator),可以在双光显微成像的引导下,使电转导将外 源基因导对活体动物体内的指定单个细胞内,通过干涉单个细胞的基因表达,并且跟踪观察其结构和功能的 变化,以及它对局部神经络的影响,研究特定细胞在为学习、络调控、甚是病程发展中的变化和作; 4. 与学院已建的神经分与细胞物学的研究平台相结合,将进步拓展研究段和研究范围,形成从分细 胞层,到神经环路结构功能,直整体动物为与功能的全位研究体系; 实验平台需要满足的条件 1.适合在体动物实验的固定载物台式正置显微镜:电动Z轴,精度≦20nm,调焦程≥25mm;电动XY轴,精度 ≦20nm,XY移动整体在体实验平台,程≥50mm; 2. 扫描成像模式:共振扫描与检流计扫描混合的式。能实现512x512像素分辨率下≥28帧/秒的成像速度; 3.双通道PMT检测模块。两个通道均配置灵敏度GaAsP PMT检测器,检测模块包含IR阻挡滤镜、红绿发射荧光分 光滤镜组。为提检测效率,检测器需紧靠物镜,并且调焦时物镜与检测器的相对位置不变; 4.成像物镜可在三维平内做任意度的倾斜,为保证成像稳定性,物镜倾斜时需保持显微镜机不移动。从物镜到 光学平台的度≥30厘,满在体清醒动物双光实验; 5.带有压电陶瓷型速物镜Z轴扫描单元,Z轴步进程≥400 微。可配合速XY扫描振镜,实现速三维Volume Scan; 6.进显微镜光路之前,激光光路中需配有普克尔盒,可实现在690 - 1020nm范围内速调节激光输出功率的能, 且可配合速XY振镜使;光路中还需配有全挡光机械快、以及功率计(实时检测激光功率); 7. 激光器峰值功率:>425 kW at 800nm >56 kW at 690 nm >217 kW at 710 nm >217 kW at 920 nm >34 kW at 1040 nm 将要购买的双光子显微成像系统的优点 1. 使共振(resonant)扫描系统具有更快的扫描速度(30帧/秒),这是传统的振镜(galvo)扫描系 统双光扫描显微镜扫描速度的8-10倍; 2. 更快地扫描速率使我们能更短的间内完成所需要的重复记录,从缩短单次记录(a single recording section)的时间; 3. 配备更加灵敏的光电探测器——磷砷化镓光电倍增管(Gallium arsenide phosphide (GaAsP) PMT), 与传统的光电倍增管(PMT)相,对光信号的敏感度和增益提3-6倍,能幅提系统的信噪, 更重要的是让我们能够对光信号更弱的结构进速成像,如更深的脑层(Layer 4, Layer 5 和 Layer 6)和亚细胞结构(树突突起和轴突的末端); 4. 配备的激光发器系统具有更窄脉冲宽度(<70 fs)的和散补偿系统,这将幅增强双光的激发 效率(excitation efficiency)。在时间(2时)的在体成像过程中,为了避免强度激光造成的组织 损伤,于成像的激光强度必须控制在较低的平(20-40毫); 5. 成像物镜可在三维平内做任意度的倾斜,这使我们可以在保持动物头部固定向上的姿势的同时, 对不在平上的脑区成像。这对清醒动物的研究很重要,因为让动物保持相对正常的姿势,对于探索 正常的为学习,有很的影响

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